目录

                １.  免疫学技术 

                       （１）. 流式细胞仪

                       （２）. 免疫组织化学染色技术

                ２.  分子(基因)诊断技术

                        （１）. 多聚酶联反应（PCR)

                       （２）. Southern 印迹法（Southern blot)

                       （３）. 荧光原位杂交（Fluorescence in situ Hybridization, FISH)

                       （４）. DNA序列测定（Sequencing）

                       （５）. 基因芯片，ＤＮＡ或蛋白点阵技术

免疫学技术

     目前通用的免疫学分类和诊断方法， 主要包括流式细胞仪和免疫组织化学染色技术。

 （１）. 流式细胞仪技术

           这是一项快速，准确，可靠的免疫学技术，可用于检查各种新鲜组织， 包括血液， 骨髓， 淋巴结，针刺活检标本 (FNA)，体液(胸腹腔积液地和脑脊液)。其过程主要包括三部份：(A) 样品制备；(B) 流式细胞仪检查；(C) 结果分析。

    Ａ. 样品制备。

     (a)。 血液和骨髓最好用肝素抗凝的试管采集。采集后标本应在摄氏2至4度保存和运输。除夜间阵发性蛋白尿外，标本需要用离心或溶解的方法去除红细胞，以收集供检查用的白细胞。

     (b)。新鲜组织(淋巴结和活检标本)应切成小于0.5厘米的小块，置于RPMI培养基中，并尽快制成单细胞悬液(一般用机械方法)。

     (c)。上述单细胞悬液经清洗后先与小牛蛋血清孵育以阻断非特异性反应，然后用单克隆抗体进行免疫荧光标记。一般需一组或多组单克隆抗体进行染色，才能最终确诊淋巴瘤或白血病。目前主要有三种或四种颜色来标记不同的单克隆抗体(FITC，PE， PERCP，ACP)。每个实验室可根据具体情况和经验来确定染色方法。根据多年的经验，本公司的专家们自行设计各种抗体组合， 用于淋巴瘤和白血病的诊断合监测治疗反应。本公司亦可根据各位顾客的特殊需要设计系列抗体组合。

    Ｂ. 流式细胞仪检查。

     标记后的抗原抗体反应物通过流式细胞仪进行检查和分析。为确保结果的可靠行，严格的质量控制是关键。除了厂家提供的调试和保养之外，仪器必须通过阴性，阳性及正常样本的测试。

    Ｃ. 结果分析。

     经流式细胞仪检查后得到的参数很多，需经综合分析后才能得出正确诊断。因而，正确的数据分析是正确诊断的关键。虽然流式细胞仪参数众多，但大致可分为 (1)细胞的大小(FS)； (2)细胞浆的颗粒度(SS)；(3)抗原抗体的表达及表达的强度。这些参数可用不同的坐标方式来表达。一般来说，SS/FS和SS/CD45 可把样本中的各种细胞分开。单核细胞，淋巴细胞， 粒细胞，浆细胞，和红细胞都有其固定的位置和数量，据此可大体判断疾病是属于那一细胞系列的问题， 然后锁定这群细胞进行分析(所谓Gate)。

      如疾病是在B淋巴细胞系列，首先确定是否是单克隆，然后再进一步分型。对T细胞系列，首先确定哪种抗原有异常表达。每一种淋巴瘤都有抗原异常表达的特徵(所谓Pattern)。确定其特徵后就可以作出客观和准确的诊断。

  （２）. 免疫组织化学染色技术

     免疫组织化学染色技术主要是应用于日常病理诊断所接触到的固定或石蜡包埋的组织，以及冰冻组织，与流式细胞仪技术相辅相成。免疫组化的原理虽然简单，但可变因素太多，要达到高度可靠和可重复性，也不是一件易事。下面是一些须知和经验之谈：

     Ａ.福尔马林固定的组织优于其他方法固定的组织。

     Ｂ.切片厚度一般不超过5微米。

     Ｃ.抗原在固定过的组织常被蒙盖，故切片须经特殊预处理，使抗原暴露。处理的方法通常是高温和蛋白酶消化。由于温度和时间掌控的不同，各个实验室得到的结果也不一样，因此每个实验室须建立一套自己的可靠和重复性高的方法。

      Ｄ.大部份免疫组化使用间接免疫荧光反应方法。特异抗体与组织或细胞反应后，酶联二级抗体再与抗原抗体反应。最后加上相应底物产生颜色，用仪器或肉眼观察。近年来由于免疫组化的大量应用，大部份实验室使用免疫组化染色机来进行染色。有信誉的免疫组化染色机生产厂家有Ventana和Dako等。需要指出的是，所用抗体必须是经过鉴定的特异性抗体，因为肿瘤的准确诊断是建立在抗体的特异性上的。自制抗体由于没有经过标准化，很可能导致非特异性反应，引起误诊，应杜绝使用。

     Ｅ.免疫组化结果的解释是诊断的关键。读片人必须结合形态学来解读染色结果，才能确定是阴性或阳性反应。举何杰金氏病的例子，用特异性抗淋巴细胞表面分子抗体染色淋巴细胞，T-细胞和B-细胞都会有不同程度的反应，但需要观察的是R-S细胞，而不是周围的T-或B-细胞。

分子(基因)诊断技术

　　 现在临床上常用的分子(基因)诊断技术主要包括多聚酶联反应（PCR)，Southern 印迹法（Southern blot), DNA序列测定（Sequencing），荧光原位杂交（Fluorescence in situ Hybridization, FISH)。其他的一些方法如基因芯片，ＤＮＡ或蛋白点阵技术可望在不远的将来应用于临床。限于篇幅，这里仅提及一些常用的技术。           

（１）. 多聚酶联反应（PCR)：

            ＰＣＲ的原理很简单，即用两个起始物同时扩增一个基因，其扩增倍率随时间呈几何级数增长。临床实验室所用的ＰＣＲ方法与研究实验室所用的没有根本性不同，但以下方面临床实验室有其特殊要求。

            Ａ. 实验室设置。由于ＰＣＲ最常见、最难避免、又是最严重的错误是由样品相互交叉污染所致，实验室的设置应遵循避免交叉污染的原则。实验室应分成至少两区，即样品准备区和ＰＣＲ反应区。两区内试剂，水，实验用具不能混用。两区内人员也不能随便进出。如实验室也开展ＲＴ－ＰＣＲ，此时应增设一个绝对分开的ＲＮＡ操作区。

            Ｂ. 试剂要求。试剂必须是出自可靠、有信誉的厂家；同样，试剂应遵循避免交叉污染的原则。在用于测试病人的样品之前，新试剂应作预试，确定其有效性。

            Ｃ. 水质标准。必须是双蒸、灭菌，经测试后无污染。

            Ｄ. 起始物的设计。应体现出高效，特异的原则。起始物的设计随根据疾病或肿瘤的临床诊断标准，流行病学，和治疗方法的不同而异。

            Ｅ. 每个试验必须有阴性，阳性和正常对照。没有阴性，阳性对照的试验结果不作为信，不能报告。

            Ｆ. 试验结果必须根据病人的临床和病理表现进行分析。切忌在没有临床和病理根据的基础上作出绝对的诊断，这点在遗传病的诊断上尤其重要。 

（２）. Southern 印迹法（Southern blot)

         将ＤＮＡ用电泳分开后转移到硝酸纤维膜上，再与同位数或其他方法标记的特异探针反应。与特异探针有反应的ＤＮＡ带即为所探测的目标基因。此法常与ＰＣＲ合用以提高检测的灵敏度。Southern 印迹法要求高质量的样品ＤＮＡ，故尽量缩短取样和作Southern 印迹的时间。

（３）。 荧光原位杂交（Fluorescence in situ Hybridization, FISH)

    此法可用于固定或包埋的组织，小范围的病灶，及难以用ＰＣＲ或Southern 印迹法检测的标本。最大的优点是它可直接在切片上染色，不足之处是需用特殊的仪器和显微镜。目前此法在细胞遗传学检测上开展得较多，主要用于发现染色体异常，如染色体转位等。许多实验室也用此法检测乳腺癌Her-2/neu的基因扩增。

（４）。DNA序列测定（Sequencing）

    常与ＰＣＲ合用，是一项发现基因突变准确、实用的方法。大多实验室现已实现机械化操作。

（５）。基因芯片，ＤＮＡ或蛋白点阵技术

    这些是非常有前景的研究领域，但都没有应用于临床诊断。本公司正在这方面积极开展研究。

    最后，需特别强调的是，不管是免疫化学染色技术还是分子(基因)诊断技术，都需要可靠的质量控制和准确无误的解释。本公司的所有病理医师均为经过严格的训练，掌握了先进的病理学和免疫学知识， 以及现代化实验室管理经验，可为各位解答所有技术性和管理上的问题，并可提供各类技术的服务指导。欢迎各位跟我们联系。